Herança epigenética de RNAs mitocondriais induzidos pela dieta e de espermatozóides (2024)

Experiência HFD - LFD em ratos (f₀–F₁)

Habitação de animais, composição da dieta e estratégias de criação

C57BL/6N Camundongos masculinos e femininos foram adquiridos da Charles River Laboratories Alemanha.Todos os animais foram alimentados ad libitum e alojados em temperatura constante (22 ± 1 ° C) e umidade controlada em gaiolas ventiladas em um ciclo de 12 h: 12 h claro/escuro.

Para o tratamento com EHFD, camundongos machos de 6 semanas de idade foram designados aleatoriamente a dois grupos alimentados por 2 semanas com HFD purificado (dieta de roedores com 60 kcal% de gordura; dieta de pesquisa D12492i) ou dieta de controle de LFD (dieta de roedores com 10 kcal% de degordura;Para tratamento de SHFD, camundongos machos de 6 semanas de idade foram designados aleatoriamente a dois grupos alimentados por 2 semanas com HFD purificado (dieta de roedores com 60 kcal% de gordura; dieta de pesquisa D12492i) ou dieta de controle de LFD (dieta de roedores com 10 kcal% de deFAT; dieta de pesquisa D12450b), acasalada com uma única fêmea virgem não exposta (para esvaziar o epidídimo) e voltou a uma dieta padrão de Chow por 4 semanas.Esses animais foram posteriormente acasalados com uma fêmea única, virgem e com partida envelhecida para gerar a coorte de filhos.

No momento do acasalamento, homens e mulheres eram alimentados ad libitum em uma dieta padrão de Chow.Para evitar o isolamento durante a gestação, os machos foram removidos da gaiola após o parto e as mães foram mantidas individualmente em toda a enfermagem e lactação recém -nascidas.O tamanho da ninhada foi ajustado para 6 a 8 sempre que o número de filhotes era maior, para evitar a desnutrição.

Os descendentes de LFD ou HFD machos e mulheres não expostos foram nomeados₁.F₁Os animais foram desmamados aos 21 dias após o parto e mantidos na dieta ad libitum de comida por toda a vida.

Todas as experiências com animais foram realizadas de acordo com a Diretiva da União Europeia 2010/63/UE e foram aprovadas pelas autoridades responsáveis do governo da Baviera superior, sob o número da licença ROB-55.2-2532.VET_02-17-33.

Todos os esforços foram feitos para minimizar o sofrimento por moradia e criação atenciosa.Todos os procedimentos de fenotipagem foram examinados para possíveis refinamentos.O bem -estar animal foi avaliado rotineiramente para todos os ratos envolvidos.Os dados de experimentos com animais são relatados de acordo com as diretrizes de chegada⁵⁹.

Oleoduto de fenotipagem

Peso corporal e massa magra e gorda relativa foram medidas em f expostos₀Animais antes e depois do desafio da dieta, bem como em Fed Fed₁Animais quinzenalmente de 4 a 14 semanas de idade.A composição corporal foi determinada por espectroscopia de ressonância magnética nuclear com um analisador de RMN Minissec (Brucker Optics), de acordo com as instruções do fabricante.IPGTTs foram realizados em f de 8 ou 12 semanas de idade₀ratos e 16 e 24 semanas de idade₁Camundongos após um período de jejum durante a noite de 16 h (das 18:00 às 10h).Uma proporção de 2 g de glicose por quilograma de peso corporal em jejum foi injetada.Os níveis de glicose no sangue foram determinados antes e após a injeção em 15, 30, 60 e 120 min usando o medidor de glicose no sangue da Roche Accuchek Aviva.As amostras de plasma foram separadas do sangue total, coletadas em microvettes revestidas com EDTA (Sarstedt) no tempo 0, 30 e 60 min, e congelados em nitrogênio líquido para análises posteriores.

Testes de tolerância à insulina foram realizados em 25 semanas de idade₁ratos após 6 h de jejum (das 6h às 12h).Os ratos foram injetados com 0,5 u de insulina por quilograma de peso corporal.A glicose no sangue foi medida antes da injeção intraperitoneal e aos 15, 30, 60 e 120 minutos usando o medidor de glicose no sangue da Roche Accuchek Aviva.

Análise de espermatogênese e função de esperma

Testes de camundongos de 8 semanas de idade expostos a 2 semanas de alimentação de LFD ou HFD foram dissecados e processados para histologia (n = 5 camundongos por dieta) e purificação de espermátides redondas para RNA e sncRNA-seq (n = 3 camundongos por dieta) ou posteriormente processados para RNA-seq unicelular (n = 3 ratos por dieta).

Coloração e histologia do testículo

As seções do testículo foram fixadas por 48 h em formalina a 10%, desidratadas através da série de etanol, limpadas em xileno e incorporadas em parafina.Após a reidratação, seções de 4 μm foram coradas com hematoxilina e eosina, de acordo com as instruções do fabricante.Para análise imuno-histoquímica, as seções de 1,5 μm foram deswaxadas por técnicas padrão.O tratamento térmico foi realizado para recuperação de antígenos em tampão de citrato de sódio.A atividade endógena de peroxidase foi extinta com 3% h₂O₂em metanol à temperatura ambiente por 5 min.A incubação com anticorpos primários foi realizada durante a noite a 4 ° C em tampão de bloqueio (TBS - entre 1%) e foram realizadas reações cromogênicas.A coloração foi realizada usando o Stainer Automatic Discovery XT (Ventana Systems), seguindo protocolos predefinidos.As seções foram submetidas à recuperação de antígenos baseados em EDTA por 20 min e bloco de proteínas (Dako, DS9390) por 12 min.As seções foram então examinadas sob um microscópio Olympus.O anticorpo primário foi TRA98 (ABCAM AB82527; 1: 1.000);O anticorpo secundário era IgG anti-rato de coelho H & L (HRP; Abcam AB6734; 1: 1.000).Os diâmetros de 60 a 70 tubuli seminíferos foram medidos a partir de áreas transversais de testículos de TRA98 e expressos como a média dos diâmetros horizontais e verticais.

Isolamento espermárico redondo

As espermatidas redondas foram isoladas usando um protocolo de gradiente de densidade modificado otimizado para espermatídeos redondos, como descrito anteriormente⁶⁰.Um mínimo de 85 a 90% de pureza foi verificado microscopicamente.O RNA total foi preparado usando o RnaEasy Mini Kit (Qiagen) de acordo com as instruções do fabricante.A concentração e a integridade do RNA foram controladas em um sistema de bioanalisador (Agilent) e apenas amostras de RNA com um valor RIN (número de integridade do RNA)> 7 foram consideradas para aplicações a jusante.Uma quantidade de 50 ng de RNA total foi usada para preparar bibliotecas totais (ribo-minus) e sncRNA-seq, conforme descrito abaixo.

Isolamento e análise de espermatozóides de Cauda

Os espermatozóides de Cauda maduros foram purificados por um procedimento de natação⁶¹de camundongos alimentados em HFD ou LFD por 2 semanas (EHFD) e/ou deixado recuperar a dieta de comida por 4 semanas após o desafio da dieta (SHFD).

Resumidamente, o Cauda e o VAS Deferens foram cortados em pedaços pequenos, colocados em 500 μl do Donners Medium (25 mm nahco₃, 20 mg ml^-1BSA, 1 mM de piruvato de sódio e 0,53% (vol/vol) de sódiodeu-Lactato em estoque de Donners;Donners Stock: 135 mm NaCl, 5 mm KCl, 1 mm mgso₄, 2 mm caacl₂e HEPES 30 mM, pH 7,4, filtrados através de um filtro de 0,22 μm e armazenados à temperatura ambiente), preenchidos até 2 ml, centrifugados por 2 min a 1.200 r.p.m.e depois incubado a 37 ° C por 1 h.Posteriormente, 1,5 ml de sobrenadante (composto principalmente por esperma móvel) foi transferido para um novo tubo de 1,5 ml, centrifugado por 2 min a 1.200 r.p.m.e incubado por 30 min a 37 ° C.Um volume de 1 ml de sobrenadante foi coletado e centrifugado por 5 min a 4.800 r.p.m.O sobrenadante foi descartado e o sedimento foi ressuspenso em um tampão de lise celular (SDS 0,01%, Triton X-100 0,005%, dissolvido em água livre de RNase) e incubado em gelo por 30 min.As amostras foram então centrifugadas a 4.800 r.p.m., lavadas com 1 × PBS frias, ressuspensas em 500 μl de reagente Trizol (Thermo Fisher) e armazenadas a -80 ° C até o processamento adicional.O RNA total foi preparado usando o RNAEasy Mini Kit (Qiagen 74104) ou o Mirneasy Micro Kit (Qiagen 1071023) de acordo com as instruções do fabricante.

Análise de fertilização in vitro e embrião

O isolamento de oócitos e a fertilização in vitro foram realizados seguindo procedimentos padronizados do consórcio de infrafrontestiadores, conforme descrito anteriormente²¹.Resumidamente, os doadores de gametas masculinos foram sacrificados aos 8 semanas de idade, após a exposição de duas semanas a LFD ou HFD.As células espermáticas maduras foram obtidas da cauda epididimis, conforme descrito acima.Os doadores de oócitos não expostos foram sacrificados no mesmo dia às 10 a 11 semanas de idade, após a superovulação induzida com 7,5 U de gonadotrofina sérica de égua grávida e 7,5 U de gonadotropina coriônica humana antes de ser morta para a coleta de oócitos.O esperma e os oócitos foram co-cultivados por 4-6 h.Posteriormente, os oócitos foram transferidos e incubados em meio de cultura de fluido tubário humano de alto cálcio (HTF) a 37 ° C e 5% CO₂.A taxa de primeira limpeza (zigoto para embriões de duas células) e a taxa de desenvolvimento de blastocisto foram medidos para avaliar o desenvolvimento embrionário e complementar a análise funcional dos espermatozóides na determinação dos efeitos da HFD na aptidão reprodutiva masculina.

Morulae foram verificadas microscopicamente e escolhidas individualmente após incubação de oócitos fertilizados em HTF de alto cálcio por 72 h.

Testes de preparação da biblioteca de RNA-seq de célula única

Testículos de ratos de 8 semanas de idade alimentados em HFD ou LFD por 2 semanas (n = 3 por grupo) foram processados para obter uma suspensão unicelular⁶⁰.Resumidamente, os testículos foram decapulados e incubados com 1 mg ml^-1Colagenase IV (3 min, 37 ° C), lavada duas vezes com 1 × krebs quentes (10 × krebs: 3,26 g kh₂DEPOIS₄, 139,5 g naCl, 5,89 g mgso₄⋅Dobra₂O, 50 g dextrose, 3,78 g cacl₂⋅Ele₂O, 7,12 g KCl em água de 2 L e filtrado com 0,22 µm) por sedimentação, incubada com DNase I mais 0,25% de tripsina (Gibco; 15–20 min a 34 ° C), filtrada com um filtro de 40 μm, centrifugado a 600g, 5 min a 4 ° C, lavado duas vezes com 1 × krebs frios e ressuspensos com 1 ml de 1 × PBS+0,04% BSA.Dez mil células foram direcionadas usando a célula única do cromo e o chip gem e o kit de esferas de gel de célula única 3 'do cromo da GEM.O kit de geme v3.1 da célula única 3 ′ de Chromium Next GEM foi usada para a síntese de cDNA e o kit de biblioteca Single Cell 3 'do Cromo Next GEM foi usado para a preparação da biblioteca após o Guia do usuário do ChromiumNextGemsingleCell3_V3.1_Rev_D (10X genômicos).As bibliotecas foram verificadas usando um 2100 Bioanalyzer (Agilent).As amostras foram emparelhadas em uma plataforma Illumina Novaseq 6000, seguindo o número de ciclos recomendados pela 10X genômica.

Testes Análise de RNA-Seq

Os dados de sequenciamento bruto foram desmultiplexados usando o MKFastQ do Ranger Cell (10X) para obter arquivos FastQ para cada amostra.As leituras desmultiplexadas foram processadas e mapeadas para o genoma do mouse (refdata-gex-mm10-2020-a), e a filtragem e a contagem exclusiva do identificador molecular foram realizadas para obter contagens de transcrição de genes em relação à célula (matriz de barcode de genes) usando o Ranger de células (versão6.0.1) Função de contagem (tabela suplementar1).

As matrizes de contagem de Cell Ranger, filtradas⁶².Para cada amostra, foi realizada filtragem adicional para selecionar células de alta qualidade.Filizamos matrizes de contagem bruta, excluindo células que expressam menos de 200 genes e genes expressos de maneira detectável expressos em menos de três células.As células com mais de 40.000 características detectadas (nFeature_RNA) por célula foram excluídas.Todas as amostras foram combinadas usando a função de mesclagem.As contagens de expressão gênica foram normalizadas com um fator de escala de 10.000 e um log (1+n) Transformação, usando a função Seurat normalizada.A função CellCycyclescoring foi usada para inferir a fase do ciclo celular, pois determina a expressão relativa de um grande conjunto de genes da fase G2/M- e S.Os genes altamente variáveis foram identificados usando a função FindVariableFeatures.O objeto Seurat foi subsequentemente escalado e analisado pelo PCA.Após o PCA, usamos a função Runharmony no pacote Harmony R⁶³para integração.

Os 30 principais componentes principais foram usados para realizar a aproximação uniforme do coletor e a redução dimensional da projeção.Em seguida, construímos o gráfico de vizinho mais próximo com a função FindNighbors com a redução como 'harmonia' e redução da dimensionalidade como 1:30.Os clusters foram então identificados usando a função FindClusters com o parâmetro de resolução de 0,3, o que resultou em 18 clusters.Os marcadores de cada cluster foram identificados usando a função FindAllMarkers com um teste de soma de classificação Wilcoxon.Os tipos de células foram atribuídos com base em conjuntos de dados de células únicas disponíveis ao público em camundongos pareados por idade⁶⁴.Os dados de expressão de genes da contagem bruta foram usados para realizar expressão de genes diferenciais para todos os clusters e em massa usando o pacote DeSeq2 (tabela suplementar2).

Preparação da biblioteca SnCrna-Seq

10 a 50 da quantidade de RNA total de espermidan redondo (50 de;n = 3 por grupo) e espermatozóides caudais (10 ng;n = 3 por grupo) de camundongos alimentados com HFD ou LFD por 2 semanas ou espermatozóides da cauda de camundongos alimentados com HFD ou LFD por 2 semanas, acasalados e autorizados a se recuperar com dieta alimentar por 4 semanas (10 ng;n = 3 por grupo) foi usado para preparação da biblioteca sncRNA. As bibliotecas foram preparadas usando o NEBNext Multiplex Small RNA Library Prep Set for Illumina (NEB E7560S) com adaptadores 5 'e 3' diluídos 1: 5 e 15 ciclos de amplificação por PCR. As bibliotecas foram verificadas usando um Bioanalyzer 2100 (Agilent) e pares (comprimento de leitura = 150 pares de bases (pb)) sequenciados com a plataforma Illumina NovaSeq 6000. Embora permita a detecção robusta de todos os biótipos de sncRNA, este método de preparação de biblioteca não captura eficientemente sncRNAs altamente modificados, como tsRNAs e rsRNAs.

Análise de SnCrna-Seq

Os dados de sequenciamento bruto foram verificados pela qualidade usando o MultiQC v1.11.As leituras foram cortadas usando o Cutadapt 2.8 de acordo com as instruções do fabricante do kit.As leituras aparadas e filtradas pela qualidade foram usadas para análises posteriores.Os arquivos de sequenciamento foram alinhados e anotados ao genoma do mouse (MM10) usando o pipeline Sports1.1⁶⁵Com os parâmetros padrão e um número máximo de incompatibilidades de 2. Referência do genoma e pequenos bancos de dados de anotação de RNA foram baixados do site de esportes (https://github.com/junchaoshi/sports1.1).Isso incluiu os arquivos do genoma MM10, o miRNA do miRbase 21, rRNA do nucleotídeo do National Center for Biotechnology Information (NCBI), tRNA do GTRNADB, PIRNA da Pirbase e Pirnabank, outros ncRNA do Ensembl (Release-89) e RFAM 12.3.As tabelas de contagem bruta geradas pelos esportes foram anotadas em pequenos biótipos de RNA.As médias foram agregadas entre os biótipos (rsRNA, tsRNA, miRNA, PIRNA e assim por diante) usando as anotações padrão em arquivos de saída de resultados esportivos.

A análise a jusante foi realizada como descrito anteriormente⁶⁶com poucas modificações.Resumidamente, as contagens foram convertidas em leituras por milhão (rpm).Os fragmentos com pelo menos 0,01 rpm em todas as amostras e comprimentos entre 16 e 45 nucleotídeos foram retidos para análise posterior.Em seguida, Edger foi usado para identificar fragmentos diferencialmente expressos.Todas as análises foram realizadas usando pacotes diferentes na versão R 4.1.2 e no biocondutor versão 3.14.

Construção da biblioteca RNA-seq

As espermatidas redondas, a construção e o seqüenciamento da Biblioteca de Cauda e da Biblioteca Morula foram terceirizados para os serviços de tecnologia da IGA.As bibliotecas foram construídas usando o kit de preparação da biblioteca Nextera (Illumina) de acordo com as instruções do fabricante e sequenciadas em um ilumina Hiseq 2500 a 75 pb emparelhado (espermatídeos redondos e morula) ou de ponta única (cauda espermatozóides), com uma saída mínimade 40 milhões de leituras por amostra.

O RNA total do tecido adiposo branco do fígado, muscular e epididimal foi preparado usando o reagente Trizol (Thermo Fisher) de acordo com as instruções do fabricante.A concentração e a integridade do RNA foram controladas em um sistema de bioanalisador (Agilent) e apenas amostras de RNA com valores de RIN> 7 foram usadas para aplicações a jusante.As bibliotecas de seqüenciamento foram preparadas usando o kit de preparação para mRNA de mRNA-seq do QuantSeq 3 'para ilumina (lexogen) com índices i7 (lexogen) de acordo com as instruções do fabricante.As bibliotecas foram sequenciadas em um Illumina HiSeq 2500 a 50 pb de ponta, com uma produção mínima de 40 a 50 milhões de leituras por amostra.

Análise de dados de RNA-seq

As leituras de mapeamento e análise de expressão diferencial foram realizadas usando o A.I.R.(Inteligência artificial RNA-seq) Software da Sequentia Biotech com o seguinte oleoduto: BBDUK (lê o corte;BBDUKGUIDE), Estrela (lê mapeamento para o genoma do mouse GRCM38 (EnsemBl);https://github.com/alexdobin/STAR), featureCounts (quantificação da expressão gênica;https://subread.sourceforge.net/featureCounts.html) e ruídoq (análise estatística de genes diferencialmente expressos;http://bioinfo.cipf.es/noiseq/doku.php).Comparado a outros métodos para calcular a expressão diferencial, o ruídoq é um método não paramétrico adaptativo de dados projetado especificamente para explicar a alta variabilidade entre réplicas e genes com baixos níveis de expressão⁶⁷, um recurso dos conjuntos de dados de RNA-seq de células germinativas e de desenvolvimento de embriões.As análises de mapa de calor e PCA foram realizadas com o aplicativo da web clustvis usando parâmetros padrão⁶⁸(Figo.1Ce dados estendidos figs.1h, Assim,Ele, Assim,6b, de8d, f) ou com o GraphPad Prism 8 ou 9. As análises de enriquecimento foram realizadas com o Enrichr⁶⁹ou G: Profiler⁷⁰com parâmetros padrão.

Para o mapa de calor na Fig.Frota do Mar Negro, plotados são conjuntos de genes anotados manualmente associados a múltiplas funções mitocondriais (consulte a tabela suplementar8para a lista completa de genes).Como a maioria desses genes tem expressão específica de tecido, plotamos o log médio₂[FC (tratado versus controle)], para o qual as condições tratadas são: exposição direta em HFD para f₀tecidos (gastrocnêmio, tecido adiposo e espermático e epidimal branco), exposições paternas para Morula (HFD versus LFD; como temos apenas dados de RNA-seq a granel) e os grupos fenotípicos discordantes HFD para ambos os embrionários de duas células (HFD_A versus_B;Figo.3e dados estendidos Fig.6para o agrupamento) e adulto f₁tecidos (hfdi versus hfdt; veja a fig.1para a definição do grupo).

Experimento de heteroplasmia

Animais e condições de criação

Um total de 60 camundongos fêmeas da cepa C57BL/6N-MT^St(DNA nuclear: c57bl/6n; mtDNA: ST, Número de acesso GenBankComo um plágio 1) dos 3 a 16 semanas foram utilizados.Os ratos eram livres de patógenos específicos de acordo com as recomendações de Felasa e mantidos em uma instalação de roedores de barreira.Grupos de 3 a 4 fêmeas foram alojados em gaiolas IVC do tipo IIL (linha azul, tecniplast).As gaiolas foram revestidas com cama de 120 g (Lignocel Select, lascas de álamo de 3,5 a 4,5 mm, rettenmaier) e enriquecidas com material de nidificação (Purzellin, Paul Hartmann) (fotoperíodo 12 h: 12 h claro/escuro).Alimentos (v1534, ssniff spezialdiaeten) e água da torneira em garrafas de 250 ml estavam disponíveis ad libitum.

Essas experiências foram realizadas na Universidade de Viena (Áustria) e todos os procedimentos experimentais foram discutidos e aprovados pelo Comitê de Ética e Bem -Estar da Universidade de Medicina Veterinária, Viena e pela Autoridade Nacional (Ministério Federal da Educação, Ciência e Ciência Austríaca,Pesquisa) De acordo com a Seção 26FF da Lei de Experiências de Animais, Tierversuchsgesetz 2012-TVG 2012 sob a licença número 2021-0.731.149.

Procedimento experimental

As camundongos fêmeas foram tratadas em grupos de 15 para superovulação por uma injeção intraperitoneal de 0,1 mL de hiperva (Cosmobio, por Hölzel) e 48 h posteriormente 5 UI em 0,1 mL de hcg (Chorulon; interten).Os animais foram sacrificados 14 h após a injeção de HCG, os ovidutos foram dissecados e as ampulas foram abertas em gotas de 90 μL de meio HTF para coletar os complexos de oócitos cumulus.Os oócitos foram fertilizados in vitro com esperma de camundongos alimentados com LFD ou HFD.Espermatozóides de quatro machos diferentes por grupo foram usados como esperma congelado - de acordo com o protocolo Emma (https://www.infrafrontier.eu/).Em cada data experimental, os ovidutos de 7,5 fêmeas foram utilizados para fertilização in vitro com um HFD masculino e ovidutos de 7,5 fêmeas para fertilização in vitro com LFD A Male.Em cada data, diferentes homens foram usados.Resumidamente, o esperma descongelado foi dissolvido em meio TYH 90 μl e incubado por 30 min.Um volume de 10 μl da solução de esperma foi adicionado a um grupo de complexos de oócitos cumulus e incubado por 4-6 h.Após a lavagem em meio HTF, os oócitos foram incubados durante a noite.Os embriões de duas células foram lavados na manhã seguinte em PBS, aliquitados em tubos de 0,2 ml com tampão de lise⁷¹, congelado em nitrogênio líquido e armazenado a -80 ° C.

RNA-Seq e análise de dados Único e dados

Um total de 122 embriões de duas células HFD e 99 LFD foram processados para obter bibliotecas RNA-seq de acordo com o protocolo Smart-Seq2⁷¹com 16 ciclos de pré-amplificação por PCR.As bibliotecas foram verificadas usando um Bioanalyzer 2100 (Agilent), sequenciadas e pareadas em uma plataforma Illumina Novaseq 6000 (comprimento de leitura = 150 pb).

A qualidade dos dados foi avaliada com o MultiQC (versão 1.11) e os adaptadores NexTERA foram removidos de leituras de extremidade emparelhada usando TRIM_GALORE (versão 0.6.6).Leia o mapeamento, a quantificação da expressão gênica e a análise de expressão diferencial foram realizadas usando o seguinte pipeline: STAR (lê o mapeamento do genoma do mouse GRCM38 (EnsemBl);https://github.com/alexdobin/STAR;Depois de substituir a sequência mtDNA de acordo com a cepa C57BL/6N-MT^St;Número de adesão ao GenBankComo um plágio 1);FeatureCounts (quantificação da expressão gênica;https://subread.sourceforge.net/featureCounts.html);DESEQ2 (pacote 1.34.0; análise de expressão gênica diferencial).A análise de enriquecimento de ontologia genética (GO) de genes diferencialmente expressos foi realizada usando G: Profiler⁷²com parâmetros padrão.Os termos plotados são os termos do driver das categorias "Função molecular" e "processos biológicos".

Os embriões individuais foram sexados usando a expressão exclusiva de genes ligados a Y.Para a análise da heteroplasmia do mtDNA, as leituras mapeadas exclusivamente foram extraídas dos arquivos BAM usando Samtools e usadas para estimar a heteroplasmia do mtDNA com o MITOHEAR (analisador de heteroplasmia mitocondrial;https://github.com/ScialdoneLab/MitoHEAR)⁷³.

Componentes principais e análises e visualização de cluster foram realizadas com o aplicativo da web clustvis⁶⁸com parâmetros padrão.

Para agrupamentos baseados em Seurat dos embriões únicos, a matriz de dados contagens da FeatureCounts foi usada como entrada no pacote Seurat para tratar a amostra individual como uma única célula.A função Seurat normalizada foi usada para normalizar as contagens.Os genes altamente variáveis foram identificados usando a função FindVariableFeatures.O objeto Seurat foi subsequentemente dimensionado usando o Scaledata e o PCA foi realizado usando RUNPCA.A função FindNighbors foi usada para construir o gráfico de vizinho mais próximo com uma redução de dimensionalidade de 1:15.Os clusters foram então identificados usando a função FindClusters com o parâmetro de resolução de 0,8.

Como uma limitação específica desse método, o Smart-Seq2 não pode detectar tRNAs fragmentados, pois não são poli-adenilados.Para explicar a penetração parcial dos fenótipos relatados, deveríamos ter perfilados SNCRNAs em embriões únicos.No entanto, de acordo com a distância genética entre o ST e o BL6 Mtdnas (que costumávamos calcular a heteroplasmia), apenas 5 'fragmentos de MT-TP seriam detectáveis de forma confiável (que tem um SNP no 5' e 3 'dosequência de tRNA madura).Portanto, embora muito provável, nossos dados não mostram a transferência de mt-tsrNAs enquanto demonstram herança de mt-tRNAs maduros paternos.

Estudos em humanos

Para a avaliação da Associação de Peso dos Pais e o fenótipo clínico das crianças da prole, analisamos dados da coorte de obesidade de Leipzig na infância (NCT04491344) e o estudo da vida para crianças (NCT02550236), um estudo observacional prospectivo de observação longitudinal regional de base populacional, destinada a caracterizar fatores contribuintes para doenças civilizadas com fenotipagem abrangente (por exemplo, clínica, laboratório, dados psicossociais e biosmaras), incluindo dados sobre IMC e IMC parentais da prole conduzida na cidade deLeipzig - Alemanha^{32, Assim,33}.Com a idade de recrutamento variando entre a 24ª semana de gestação e 16 anos de idade infantil e acompanhamentos anuais, o estudo combina uma seção transversal com um projeto longitudinal e cobre uma ampla faixa etária.A sub-estudo da obesidade infantil da vida se concentra especificamente na origem e sequelas da obesidade infantil no quadro da coorte de obesidade da infância de Leipzig.Após a exclusão de crianças com doenças presentes ou passadas graves (por exemplo, diabetes tipo 1, obesidade síndromal ou câncer) e tratamento médico interferente ou passado (por exemplo, insulina, imunossupressores ou hormônio do crescimento), incluímos aquelas crianças com ambos os BMIS parentaisDisponível na análise (n = 3431; Tabela Suplementar3).No caso de várias visitas, usamos dados antropométricos da visita mais recente da criança.Para dados dos pais, usamos o primeiro (isto é, o mais próximo da primeira visita à gravidez).

A expressão de genes candidatos derivados de dados de expressão em todo o genoma foi analisada de crianças incluídas na coorte de tecido adiposo de Leipzig, para as quais amostras de tecido adiposo subcutâneo e dados fenotípicos foram obtidos como descrito anteriormente³⁰(NCT02208141).Os níveis de transcrição de RNA foram quantificados usando as matrizes e imputação da expressão ilumina HumanHT-12 V4.0 e imputação, correção de fundo e controle de qualidade foram realizados de acordo com protocolos publicados anteriormente⁷⁴.

Para corrigir a associação poligênica de IMCs de crianças, analisamos 2.987 filhos de nossas coortes para os quais estão disponíveis dados de matriz SNP em todo o genoma, IMC-SDs e IMCs dos pais.A matriz de relacionamento foi estimada de acordo com a ref.⁷⁵.O efeito poligênico nos IMCs de crianças foi subtraído por análise de modelo misto linear usando o pacote R genabel.Em seguida, testamos os efeitos do IMC pai nos IMCs de crianças por análise de regressão linear, ajustando a idade e o sexo.

SnCrna-seq de espermatozóis humanos

Coleta de amostras.As amostras foram fornecidas por nossos colaboradores de pesquisa da Universidade de Turku.Após um consentimento informado, as amostras de sêmen foram dadas por 18 jovens voluntários (19 a 21 anos).Os homens participaram de um estudo sobre saúde reprodutiva masculina, aprovada pelo Comitê de Ética Conjunto do Hospital Universitário da Universidade de Turku e Turku.A abstinência de ejaculação de pelo menos 48 h foi recomendada antes da coleta de amostras de sêmen.Análise padrão de sêmen, incluindo volume de sêmen, pH, concentração de espermatozóides, contagens totais de espermatozóides e porcentagem de esperma móvel, foi realizada de acordo com os critérios do Laboratório da Organização Mundial da Saúde no Laboratório Andrology do Instituto de Biomedicina.Os espermatozóides foram purificados por centrifugando por um gradiente de 50% do Puresperm (Nidacon International).Após a lavagem da amostra com PBS, a pureza foi avaliada microscopicamente, os espermatozóides foram contados e a amostra foi avaliada quanto à contaminação celular somática.O pellet foi ressuspenso no esperma crioprotec II (Nidacon International AB) e o pellet congelado foi enviado para a Alemanha.Na Alemanha, os espermatozóides foram purificados a partir da contaminação celular somática lavando com tampão de lise celular somática⁷⁶.A pureza das amostras foi validada microscopicamente.Informações detalhadas da amostra, incluindo esperma e parâmetros metabólicos podem ser encontrados na tabela suplementar4.

Isolamento do RNA.O RNA total foi extraído de espermatozóides com o método de separação de fase Trizol -Clorofórmio, seguido de etapas de precipitação e lavagem com etanol 100% e 70%, respectivamente.O controle da qualidade do RNA foi realizado com bioanalisador agilente e apenas as amostras com um valor de RIN entre 2 e 4,5 e nenhum pico evidente de RNA ribossômico intacto foi processado posteriormente.

Preparação da biblioteca.As bibliotecas de seqüenciamento foram preparadas usando o NebNext Small RNA Biblioteca Prep para Illumina (New England Biolabs) com RNA de 100 a 120 ng como uma entrada total.Para minimizar a formação do adaptador-dímero, os adaptadores foram diluídos 1: 6, enquanto o iniciador de transcrição reversa foi aplicado não diluído.Na fase final da PCR, foram utilizados iniciadores diluídos 1: 2.As bibliotecas amplificadas foram limpas com o kit de limpeza de PCR e DNA monarca (biolabs da Nova Inglaterra) e tamanho selecionado com ampure XP (Beckman Coulter) usando contas 1,0 × e 3,7 × para remoção de longa duração e retenção de tamanho alvo, respectivamente.As bibliotecas combinadas foram sequenciadas em uma célula de fluxo do Novaseq 6000, SP, 100 ciclos (Illumina) a uma profundidade média de 53,18 milhões de leituras por amostra.

Análise de dados.Todos os arquivos de sequenciamento foram verificados de qualidade usando o MultiQC v1.11.Após uma verificação preliminar de qualidade, as seqüências de leitura de ponta única foram analisadas usando o Sports1.1 (ref.⁶⁵).A sequência do adaptador (5'-agatcggaagAgCaccgtctgaactccagtca-3 ') foi aparada usando o pipeline cutadapt embutido e as sequências com o comprimento de 15 a 45 nucleotídeos foram processadas posteriormente.Usando a versão do genoma humano HG19 e permitiu o número de incompatibilidade definido como 2, Sports1.1 Leia para pequenos subtipos de RNA.Depois de ingressar em sequências de todas as amostras em uma matriz de contagem comum, um filtro foi aplicado para excluir sequências sem leituras em mais de 80% das amostras.As amostras foram ainda analisadas com base na variação do IMC.A análise de expressão diferencial baseada em sequência foi realizada usando o DESEQ2 (ref.⁷⁷) abordando o IMC como uma variável contínua.Resumidamente, um algoritmo baseado em modelo linear generalizado estimou a associação de cada sequência com o IMC entre amostras e log de saída₂[FC] refletindo a mudança no nível de expressão de sequência por unidade de incremento do IMC.Benjamini - HochbergP_adj < 0,1 serviu como medida de significância para cada resultado. A análise de correlação baseada em Pearson entre o IMC dos doadores e os biótipos de sncRNA de esperma (expressão normalizada por transformação estabilizadora de variância) foi realizada com o GraphPad Prism 8 usando parâmetros padrão.

A string a seguir representa o código usado para a análise contínuaDeSEQ2 dos dados de snncRNA-seq de esperma humano: dd_obj <- deseseqdatasetfromatrix (countData = [sua matriz de contagem de sequência], Coldata = [quadro de dados com idiota e valores de IMC], design = ~ bmi).

Coleta e análise de dados do consórcio de fenotipagem internacional de mouse

O objetivo é fornecer evidências em apoio à hipótese de que a disfunção mitocondrial paterna leva a alterações intergeracionais da homeostase metabólica.O IMPC oferece um recurso inestimável de estudos de genética funcional²⁹.Resumidamente, usamos o conjunto de dados IMPC para estudar as consequências intergeracionais (EPI) genéticas da manipulação paterna de genes envolvidos na estrutura e função mitocondrial.

Para isso, comparamos uma bateria de 11 fenótipos metabólicos numéricos (peso da gordura/corpo; resposta inicial à carga de glicose intraperitoneal; AUC;_ipgtt;ingestão total de alimentos;razão de troca respiratória;Colesterol total;Colesterol HDL;triglicerídeos;glicose no sangue em jejum;albumina;fosfatase alcalina) em duas populações de camundongos isogênicos WT C57BL/6N gerados a partir de uma linhagem pura (controle) ou a partir de cuidados heterozigotos (WT - Informações parentais (pai × mãe): het_ × _het; het_ × _wt; wt_ _het).

Seleção de genes

A seleção de genes envolvidos na estrutura e função das mitocôndrias foi realizada com as seguintes etapas: a partir da lista de genes IMPC (liberação de dados 11), extraímos aqueles que apresentam um ou mais dos fenótipos metabólicos listados acima na heterozigosidade;Análise de Enriquecimento Funcional (Análise da via GO e KEGG usando enrichr⁶⁹);Lista de genes selecionados compilados pela fusão de genes pertencentes aos seguintes termos relacionados ao MT (GO: 0005739;GO: 0005743;GO: 0005759;GO: 0031966;GO: 0042645;GO: 0005747;GO: 0005761;GO: 0005763;GO: 0005749;GO: 0032592;KEGG: MMU00190;Tabela suplementar5).

Coleta e análise de dados

Como os centros individuais de fenotipagem de fenotipagem de controle de fenótipo e/ou animais WT (veja a definição acima) e considere-os como controle WT para fenótipos específicos de genes, os dados específicos de controle ou WT não são diretamente identificáveis no site da IMPC.Portanto, recebemos acesso especial aos dados da IMPC para uma coleta específica de controle e informações fenotípicas de WT.Após a coleta, o conjunto de dados foi organizado em uma matriz de dados multidimensional para análise posterior.Animais com pelo menos três réplicas por grupo e sexo foram incluídos para outras etapas.A imputação dos dados ausentes foi realizada com um algoritmo aleatório de imputação florestal usando o pacote Missforest com parâmetros padrão⁷⁸.A matriz de dados foi então dimensionada e a função Prcomp em r foi usada para determinar os principais componentes do conjunto de dados.Para quantificar a diferença entre os genes com base nos fenótipos, usamos o método de correlação de Pearson usando a função get_dist do pacote FACTOEXTRA R.Esses coeficientes de correlação foram calculados para identificar padrões de similaridade em pares de genes-fenótipo e visualizados em um mapa de calor gerado usando o pacote complexoheatmap de fenótipos específicos de R., bem como sexo e sexo eInformações específicas para pais de origem.AUC classificado_ipgtt(expresso como log₂[FC (WT versus controle)]) foi plotado como um gráfico de barra horizontal usando o GraphPad Prism 9.

Coleção de esperma criopreservada

Amostras de esperma criopreservadas contendo um conjunto de espermatozóides de cauda purificados de 10 camundongos heterozigotos foram obtidos de Emma⁵⁶.Os genes foram selecionados para disponibilidade, com exceção deTsfm(Fator de alongamento de tradução TS, mitocondrial), que representa um controle negativo adequado para a dissecção mecanicista inicial.

Isolamento de RNA e construção de bibliotecas snCrna-seq

Os canudos individuais foram descongelados diretamente em Trizol e o RNA foi extraído com o Mirneasy Micro Kit (Qiagen 1071023) de acordo com as instruções do fabricante.Uma quantidade de 10 ng de RNA total foi usada para a preparação da biblioteca SNCRNA.As bibliotecas foram preparadas usando o conjunto de preparação para bibliotecas de RNA pequeno do Nebnext Multiplex para Illumina (Neb E7560S) com adaptadores de 5 'e 3' diluídos por ciclos de amplificação de 1: 5 e 15 de PCR.As bibliotecas foram verificadas usando um 2100 Bioanalyzer (Agilent) e de extremidade pareada (comprimento de leitura = 150 pb) sequenciadas com a plataforma Illumina Novaseq 6000.

Análise de dados SNCRNA-SEQ

Os dados do SNCRNA-seq foram analisados como descrito acima.Resumidamente, os dados brutos de sequenciamento foram verificados pela qualidade usando o MultiQC v1.11.As leituras foram cortadas usando o Cutadapp 2.8 de acordo com as instruções do fabricante do kit.As leituras aparadas e filtradas pela qualidade foram usadas para análises posteriores.Os arquivos de sequenciamento foram alinhados e anotados ao genoma do mouse (MM10) usando o pipeline Sports1.1⁶⁵Com parâmetros padrão e um número máximo de incompatibilidade de 2. Os bancos de dados de referência do genoma e de anotações de RNA foram baixados do site de esportes (https://github.com/junchaoshi/sports1.1).Isso incluiu os arquivos do genoma MM10, miRNA do miRBase 21, rRNA do nucleotídeo NCBI, tRNA do GTRNADB, PIRNA da Pirbase e Pirnabank, outro ncRNA do EnsemBL (Release-89) e RFAM 12.3.As tabelas de contagem bruta geradas pelos esportes foram anotadas em pequenos biótipos de RNA.As médias foram agregadas entre os biótipos (rsRNA, tsRNA, miRNA, PIRNA e assim por diante) usando as anotações padrão em arquivos de saída de resultados esportivos.

Análise Estatística

Todas as figuras e análises estatísticas (conforme necessário e apropriado) foram geradas usando o GraphPad Prism 8 ou 9. A significância estatística foi testada pelo alunot-Test, ou ANOVA, conforme apropriado.As análises de correlação foram usadas para testar a regressão linear.Odds ratios foram calculados usando MedCalc (https://www.medcalc.org/calc/odds_ratio.php).Todos os dados são expressos como média ± s.e.m.e um bicaudalP valor < 0,05 foi considerado para indicar significância estatística, a menos que especificado de outra forma no texto.

Resumo do relatório

Mais informações sobre o design da pesquisa estão disponíveis noResumo do relatório do portfólio da naturezaligado a este artigo.